长期以来，对单个细菌细胞的基因组进行测序在技术上一直存在困难，因为该过程的基因扩增阶段似乎存在不可纠正的偏差，因此很难仅从一个细菌细胞中产生高覆盖率的基因组序列。

然而，中国科学院青岛生物能源与过程研究所(QIBEBT)单细胞中心的研究人员开发的一种新工艺大大减少了这种偏差，开辟了单细胞研究的全新前景。

该研究于 6 月 29 日发表在《生物工程和生物技术前沿》上。

(资料图)

使用传统基因测序方法时，同时使用数百万个细胞是正常的。但这种批量细胞测序不可避免地消除了细胞之间的差异，使得探索不同细胞谱系之间的关系或进行任何其他类型的依赖于一次考虑单个细胞的研究变得困难。这种技术挑战对于细菌来说尤其严峻，因为细菌细胞非常小，其 DNA 含量比人类或动物细胞低几个数量级。

为了对基因或整个基因组进行测序，首先必须“扩增”DNA。基因扩增，有时称为“分子复印”，可以复制数百万甚至数十亿的 DNA 片段。

扩增对于批量基因测序来说几乎没有什么问题。然而，在细菌单细胞 DNA 扩增中，特别是整个基因组，可用于复制的 DNA 量非常有限，并且扩增过程可能会引入过度代表或不足代表基因组不同区域的偏差。

“减少扩增偏差一直是单细胞基因组扩增研究人员的圣杯，”QIBEBT 的生物技术专家、该论文的主要作者张佳说。“我们认为我们现在已经找到了解决这个问题的方法。”

研究人员开发了一种称为改进单细胞基因组扩增(iSGA)的过程。它主要涉及蛋白质工程以及phi29 DNA聚合酶扩增能力的工艺工程。phi29 DNA聚合酶常用于单细胞全基因组扩增，但存在基因组覆盖度低、效率低的问题。

“我们开发的 iSGA phi29 DNA 聚合酶的效率和稳定性是传统 phi29 DNA 聚合酶的两倍以上，”张佳说。“它也比主要的常用商业版本便宜近十一倍。”

研究人员通过改造聚合酶以提高其扩增能力来实现这一目标。他们使用一种称为区室化自我复制 (CSR) 的方法来进化 phi29 DNA 聚合酶，修改其结构以增强其活性、特异性和稳定性。“与现有的商业聚合酶相比，新开发的 DNA 聚合酶，我们称之为 HotJa Phi29 DNA 聚合酶，在更高的温度(40℃)下显示出明显更好的基因组覆盖率(99.75%)，”资深作者、来自 Single- QIBEBT细胞中心。

他们还优化了扩增反应条件并修改了扩增缓冲液(为DNA聚合酶提供合适的化学环境的溶液)，以提高phi29 DNA聚合酶的稳定性和活性。此外，研究人员还开发了一种更有效的净化方法，以减少扩增过程中的污染。

研究人员现在计划在各种应用和样本类型中优化他们的 iSGA 方法和 HotJa Phi29 DNA 聚合酶，并进一步降低成本。该团队开发了包括RACS-Seq、FlowRACS和EasySort在内的一系列仪器，用于微生物单细胞的功能分选。他们的目标是通过开发这些仪器和试剂，使微生物学家能够对地球上的任何单个微生物细胞进行分类和测序，而无需担心数据质量或试剂成本。

关键词：